Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Культивирование фибробластов человека

Культуральная посуда и оборудование

Пипетки мерные от 1 до 10 мл, пипетки Пастера, пенициллиновые флаконы, пробирки Лейтона, мерные флаконы от среды разных объемов, пробки резиновые № 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения их в пенициллиновые флаконы, пинцеты глазные анатомические и хирургические, зажим Кохера, бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали, резиновая груша для работы с пипетками (с надетой резиновой трубкой), инвертированный микроскоп, ламинар-окс, термостат.

Питательная среда

Фибробласты успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды — среда Игла — 90–85 %, сыворотка крупного рогатого скота — 5-10 %, пуповинная сыворотка человека (фетальная сыворотка) — 5 %, глютамин — 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при 4 °C. При культивировании эксплантов рекомендуется использовать антибиотики (40–60 мкг канамицина на 1 литр среды).

Ход работы

1. Взятие биопсии. Фибробласты можно получать из многих тканей и органов. Проще всего — фибробласты дермального слоя кожи. Наиболее удобно брать биопсию со внутренней стороны предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70 % этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы, так как в случае проникновения в биопат они могут оказать токсическое действие. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отрезают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться взять глубокие слои кожи. При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимально. Отсечение лучше проводить лезвием безопасной бритвы, простерилизованной (как и пинцет) путем погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсеченный кусочек погружается в заранее приготовленный пенициллиновый флакон со средой. На рану накладывают бактерицидный пластырь. Фрагмент кожи может храниться в питательной среде при 4 °C в течение 3–4 суток без утраты фибробластами способности к росту.

2. Получение экспланта. В стерильную чашку Петри с каплей 0.25 % раствора трипсина или питательной среды помещают фрагмент кожи. Придерживая пинцетом, нарезают на мелкие кусочки величиной с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покровным стеклом, слегка прижимая препаровальной иглой. Наливают в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками кожи при помощи пинцета кладут на боковую стенку пенициллинового флакона. Флаконы плотно закрывают пробкой и устанавливают на подставке под углом примерно в 30°. Культуры инкубируют в термостате при 37 °C. В течение недели следят за цветом среды. Изменение цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем состоянии экспланта.

Через неделю ежедневно начинают просматривать культуру под микроскопом. Можно использовать как инвертированный, так и обычный микроскоп. В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при этом стекла с культурой прилипают к боковой стенке флакона и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков вначале появляются единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпителия, окружающий фрагмент в виде "кружевного" ореола. При появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки займут все пространство между кусочками (это видно невооруженным глазом или при помощи лупы), их пересевают.

Пересев фибробластов человека

Материалы и оборудование

Флаконы с питательной средой, трипсин, покровные стекла, пипетки, препаровальные иглы.

Пересевы производят для получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования, а также для криоконсервации. Клеточный штамм считают установившимся, если после пассирования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3–4 суток после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое, что позволяет пересевать такие клетки в отношении 1:2 (из одного сосуда в два).

Ход работы

Удаляют питательную среду из культурального сосуда и наливают 2–3 мл подогретого 0.25 % раствора трипсина (или смесь версен-трипсин). Через 2 минуты удаляют трипсин, оставив его только между стеклами. Инкубируют в термостате 15–20 минут при 37 °C. Ход трипсинизации можно контролировать, просматривая культуры под микроскопом.

По окончании трипсинизации при помощи препаровальной иглы отделяют одно стекло от другого и при помощи тонко оттянутой пипетки смывают клетки небольшим количеством среды (1 мл). При этом несколько раз пропускают через пипетку суспензию клеток и кусочки. Суспензию клеток переносят в пенициллиновый флакон и добавляют среду до 2–3 мл. Оставшиеся в прежнем сосуде кусочки снова укладывают между двух покровных стекол и заливают средой. От этих вторично культивируемых эксплантов может быть получен второй "урожай" клеток.

Флакон с пересаженными растущими фибробластами просматривают ежесуточно под микроскопом. Когда образуется слившийся слой клеток, производят второй пересев (обычно через 4–7 суток).

Контроль штаммов

Ежедневный просмотр культуральных сосудов для оценки цвета среды и её прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении. Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или сдвигается в сторону малинового, это может быть связано с отсутствием размножения клеток, с недостаточным количеством для данного объема или гибелью. При помощи инвертированного микроскопа оценивается морфология клеток и слоя в целом.

В нормальных условиях фибробласты — веретенообразные вытянутые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка на субстрате (фибробласты обладают ориентированным ростом), появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток, распластанность клеток свидетельствует об их дегенерации в результате токсических или иных вредных воздействий. Небольшое количество среды после каждого пересева отливают для проверки на стерильность, которую производят путем посева на агар.

ПРАКТИКА