Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ — высокие значения pH — высокая концентрация Са2+", которая дает до 50 % слившихся протопластов (pH 9-11, концентрация Са2+ 100–300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция — их слияние. Предполагают, что pH и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостномозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния — АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции — желто-зеленый и красный.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений.

2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид — продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) — растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов у-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам — маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984).

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды — продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут быть выращены растения — регенеранты.

Виды соматических гибридов

Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca, с 24 хромосомами и N.langsdorfii с 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.

Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные. Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу «У», чем отличался от полового гибрида.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (X. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид. Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.

Ю. Ю. Глебой с сотрудниками проводились многочисленные эксперименты по созданию межтрибных гибридов. Триба — таксономическая единица между семейством и родом. Получены удачные гибриды между Arabidopsis и Brassica (турнепс) Arabidobrassica. У гибридных линий индуцировали морфогенез корней и растения. Растения генетически и морфологически униформны, не цвели. На вид — уродливы, очень много тератомоподобных образований, похожих на цветки.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых Datura innoxia + Atropa belladonna. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Амфиплоиды оказались неспособны к стеблевому морфогенезу, в линиях с полиплоидным и анеуплоидным наборами хромосом получали аномальные стебли. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.

Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 — аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные — зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение[71]" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.