Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

— среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами — для культивирования клеток и тканей высших растений.

Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение, приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии. Ниже вы найдете прописи для базовых сред для культивирования растительных клеток: среда Мурасиге-Скуга и среда Гамборга, некоторые микробиологические среды.

Состав питательных сред для растительных клеток

Среда Мурасиге-Скуга

Компоненты ∙ Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг ∙ Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды

— маточный раствор макроэлементов

NH4NO3 ∙ 33000 ∙ 50

KNO3 ∙ 38000

СаСl2*2Н2O ∙ 8800

MgSO4*7H2O ∙ 7400

КН2РO4 ∙ 3400

— маточный раствор микроэлементов

KJ ∙ 166 ∙ 5

Н3ВО3 ∙ 1240

MnSO4*H2O ∙ 4460

ZnSO4*7H2O ∙ 1720

Na2MoO4*2H2O ∙ 50

CuSO4*5H2O ∙ 5

СоСl2*6Н2O ∙ 5

— маточный раствор хелатного железа

FeSO4*7H2O ∙ 5560 ∙ 5

Nа2ЭДТА*2Н2O 7460

— витамины и органические вещества

Мезоинозит ∙ 20000 ∙ 5

Никотиновая кислота ∙ 100

Пиридоксин-НСl ∙ 100

Тиамин-НСl ∙ 100

Глицин ∙ 400

— Добавлять в виде порошка в среду перед варкой:

Сахароза ∙ 30 г/л

Агар-агар ∙ 7 г/л pH

готовой среды ∙ 5.6–5.8

* для получения стерильных проростков на 1 литр среды берут 1/2 часть маточных растворов, т. е. вместо 50 мл раствора макроэлементов берут 25 мл и т. д.

Среда Гамборга (В5)

Компоненты ∙ Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг ∙ Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды

— маточный раствор макроэлементов

(NH4)2SO4 ∙ 2680 ∙ 50

KNO3 ∙ 50000

СаСl2*2Н2O ∙ 3000

MgSO4*7H2O ∙ 5000

NaH2PO4*H2O ∙ 3000

— маточный раствор микроэлементов

KJ ∙ 75 ∙ 10

Н3ВО3 ∙ 3300

MnSO4*H2O ∙ 1000

ZnSO4*7H2O ∙ 200

Na2MoO4*2H2O ∙ 25

CuSO4*5H2O ∙ 25

СоСl2*6Н2O ∙ 2.5

— маточный раствор хелатного железа

FeSO4*7H2O ∙ 5560 ∙ 5

Nа2ЭДТА*2Н2O ∙ 7460

— витамины и органические вещества

Мезоинозит ∙ 10000 ∙ 10

Никотиновая кислота ∙ 100

Пиридоксин-НСl ∙ 100

Тиамин-НС1 ∙ 1000

— Добавлять в виде порошка в среду перед варкой:

Сахароза ∙ 30 г/л

Агар-агар ∙ 7 г/л pH

готовой среды ∙ 5.5

Питательные среды для микроорганизмов и их приготовление[84]

1. Приготовление бобового агара

В 1 литре воды кипятят 100 г белой фасоли или белых бобов до готовности, избегая растрескивания бобов и превращения крахмала в клейстер. Отвар фильтруют в горячем виде и добавляют 2 % агара. Стерилизуют в автоклаве как обычно.

2. Приготовление среды для хлореллы

В качестве среды для культивирования зеленых водорослей можно использовать раствор Кнопа (г/литр раствора):

Са (NO3)2 — 0.25

MgSO4*7H2O — 0.06

КН2РO4 — 0.06

КСl — 0.08

Fе2Сl6 — одна капля 1 % раствора (можно заменить раствором хелатного железа из среды МС, 50 мл маточного раствора).

На растворе Кнопа можно также выращивать и ряску.

3. Приготовление среды для цианобактерий

Для культивирования цианобактерий рекомендуется среда Чу N 10 (г/литр раствора):

Са(NO3)2 — 0.04

MgSO4*7H2O — 0.025

KH2PO4 — 0.01

Na2CO3 — 0.02

Na2SiO3*9H20–0.025

FeCl3*6H2O — 0.0008 (также можно заменить хелатом железа)

4. Приготовление питательного агара для грибов (агар Чапека)

Состав среды Чапека (г/литр раствора):

Сахароза — 30 г

NaNO3 — 3 г

КН2РO4 — 1 г

MgSO4*7H2O — 0.5 г

КСl — 0.5 г

FeSO4*7H2O — 0.01 г

Агар-агар — 15 г

На дно колбы насыпать агар (можно брать пол-литровые обычные бутылки, тогда на 1 литр среды необходимы 3 бутылки, в каждую их которых насыпать 1/3 агара, т. е. 5 грамм) и залить раствором солей. Колбу или бутылки поставить в автоклав на стерилизацию на 20 минут. После стерилизации, покачивая колбу, тщательно перемешать содержимое, иначе агар останется на дне, и застынет только нижний слой среды.

В боксе среду разлить по стерильным чашкам Петри или пробиркам. Проверить на бактериальное заражение, выдержав 3–4 дня при комнатной температуре. В дальнейшем лучше хранить в холодильнике, так как там среда меньше испаряется.

5. Среда Прата для хранения коллекции культур водорослей

Длительно выдерживать зеленые водоросли без пересева не рекомендуется, так как водоросли могут прекратить свой рост в результате самоотравления продуктами жизнедеятельности. Признаками такого угнетения могут служить пожелтение культуры, появление белесого оттенка на среде и ее помутнение. Сохранить коллекцию водорослей можно на твердых питательных средах, где рост культуры замедлен, поэтому частые пересевы не требуются (раз в месяц, а если хранить при слабом рассеянном свете при температуре 10–15 °C, то и раз в два месяца). Состав среды Прата (г/литр раствора):

KNO3 — 0.10

MgSO4*7H2O — 0.01

К2НРO4 — 0.01

FeCl3*6H2O — 0.001

агар-агар — 12 г

Среду простерилизовать.

Методики культивирования клеток

Начнем с того, что растительные и животные клетки предъявляют совершенно различные требования к условиям культивирования.

Для животных клеток диапазон оптимального существования очень узок. Это касается и температурных условий, и состава питательных сред (необходимо строго выдерживать pH, молярность и т. д.), и газового состава. Пожалуй, наименее требовательны они к освещению. Для выращивания животных клеток всегда используют готовые фабричные питательные среды, а для длительного поддержания линии нужен термостат. Для некоторых видов клеток газовый состав воздуха можно обеспечить, поместив флаконы с культурой в эксикатор (емкость с притирающейся крышкой) в который также помещают горящую свечку. Когда эксикатор плотно закрыт, свеча затухает сама при концентрации углекислого газа в воздухе 5 %.

Подробнее о условиях культивирования животных клеток и культивировании органов можно прочесть в учебнике по биотехнологии.

Заводить и вести культуру растительных клеток гораздо проще. Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27 °C, в темноте или при освещении. Среды для них — несложные, и их легко приготовить самому. Культивировать можно на твердых питательных средах с добавлением агар-агара, крахмала (методика изложена в главе "питательные среды" или на жидких питательных средах, с использованием мостиков из ваты и фильтровальной бумаги.

Суспензионные культуры растительных клеток поддерживать гораздо сложнее — необходима мешалка для постоянного перемешивания среды. Иначе эксплант погиб нет, в первую очередь, от отсутствия доступа кислорода.

Условия освещения различны в зависимости от поставленных вами задач. Каллусную ткань обычно получают в темноте. Клональное микроразмножение проводят при освещении. В качестве источника света лучше пригодны лампы дневного света. Они не нагревают камеру и имеют более или менее подходящий для растений спектральный состав света.