Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Рис. 14. Система культуры в колонке

В такой системе возрастает число клеток, на которые капает среда, что увеличивает "зону капания", где происходит накопление больших количеств вторичных метаболитов.

Сосуд для культивирования из горизонтального превращается в вертикальный. В сосуде с питательной средой (1) 50 мл жидкой среды, которая под действием силы тяжести капает в вертикальную стеклянную колонку, содержащую иммобилизованные клетки (3). Среду собирают со дна колонки и вновь используют в цикле, перекачивая с помощью перистальтического насоса в резервуар со средой.

Как разместить клетки внутри колонки, чтобы капающая среда не спрессовала их в плотную массу на дне колонки? Закрепить в нейлоновую сеть, корзиночки, используя инертный, проницаемый и стабильный гель. Между корзиночками образуется воздушное пространство, сеточка структурирует гель, а клетки могут прорастать через корзиночки, контактируя друг с другом.

Подходящим материалом для размещения клеток оказались нейлоновые мочалки. Материал нетоксичен, легко режется, выдерживает автоклавирование. В качестве субстратов для погружения клеток используют агар и альгинат кальция.

Агар традиционно используется в работе с культурами клеток и тканей. 2 % (масса к объему) раствор агара в дистиллированной воде автоклавируют при 1 атмосфере в течение 20 минут и охлаждают на водяной бане до 35–40 °C. Клетки суспензионной культуры в стационарной фазе роста пропускают через сито с диаметром пор 1 мм и смешивают в пропорции 1:1 (V: V) с незастывшим агаром. Стерильные кусочки мочалки 2–3*1*1 см с помощью стерильного пинцета опускают в смесь клеток с агаром, а когда агар начинает застывать, помещают в стерильные колонки с внутренним диаметром 15*2,5 см. В каждую колонку помещают примерно 10 сеточек, таким образом, на колонку приходится 5–7 г сырой массы клеток.

Аналогично иммобилизуют клетки с использованием альгината кальция. В этом инертном субстрате, например, успешно были иммобилизованы А. Альферманном с сотрудниками клетки наперстянки шерстистой (Digitalis lanata). 2 % раствор альгината натрия автоклавируют, охлаждают до комнатной температуры, смешивают с клетками и переносят в стерильный раствор 0,05 М СаСl2 в дистиллированной воде на 10 минут, чтобы образовывающийся альгинат кальция затвердел внутри и вокруг кусочков мочалки, обволакивая клетки. Молекулы альгината поперечно сшиваются катионами кальция, при этом происходит его стабилизация. Затвердевший материал трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и вносят в стеклянные колонки.

Как показали дальнейшие исследования, рост клеток в альгинате был лучшим, чем в агаре, что связано, вероятно, с негативным действием расплавленного агара, температура которого составляет около 40 °C, на клетки в процессе иммобилизации. Поэтому эксперименты по изменению условий окружающей среды проводились в колонках, где клетки Datura innoxia и Capsicum frutencens были иммобилизованы в альгинате кальция.

Скорость потребления ортофосфата, нитратов, аммония и сахарозы в клетках колоночной культуры ниже, чем в горизонтальной системе. Жизнеспособность клеток, по сравнению с суспензионными культурами, заметно не снижается (60–65 %), содержание алкалоидов через 8-10 суток составляет 12–13 мг/г сухой массы клеток, алкалоиды в питательную среду не выделяются, а pH среды после 8 суток культивирования снижается на 0,4 единицы, до 5,4. Определение скорости потребления кислорода показывает предположительную нехватку его на 4–8 сутки культивирования.

Культуры, освещаемые люминесцентными лампами, потребляют питательные вещества интенсивнее, рост клеток лучше также в освещенных культурах. В светокультуре повышается жизнеспособность клеток и содержание алкалоидов. Так как клетки не зеленеют, для поддержания нормального клеточного метаболизма необходимы и другие световые эффекты.

Добавление предшественников не всегда однозначно влияет на рост, потребление питательных веществ и синтез метаболитов. Например, действие орнитина на клетки Datura innoxia скорее отрицательно, а изокаприновой кислоты на клетки Capsicum frutencens — скорее положительно, так как сырая масса увеличивается, но выход капсомицина остается прежним. В обоих случаях синтез метаболитов не ингибируется альгинатным гелем.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении жизнеспособности клеток многих видов растений при иммобилизации. Иммобилизованные клетки, полученные из рыхлых, быстро растущих суспензионных культур, замедляют рост и приобретают сходство с клетками каллусной культуры. Эти клетки более взаимосвязаны, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенного физического и химического градиентов.

Иммобилизованные клетки аккумулируют больше алкалоидов, чем в жидкой культуре, что ведет к возникновению определенных физических и химических градиентов. Это способствует переходу клеток в стационарную фазу, что приводит к ускорению образования алкалоидов и других веществ вторичного происхождения.

Общие рекомендации к культивированию клеток на основе полученных результатов.

1. Клетки должны выращиваться физически стационарно, в тесном контакте друг с другом, чтобы стимулировалось развитие физических и химических градиентов и обеспечивалась частичная дифференцировка культуры. Некоторые виды растений необходимо культивировать при освещении и индуцировать образование хлоропластов, чтобы обеспечить уровень метаболизма, близкий к происходящему в клетках интактного растения.

2. Состав питательной среды и уровень кислорода необходимо регулировать для замедления роста культуры. Рекомендуется использовать регуляторы роста для имитации процессов дифференциации, происходящих in vivo.

3. Клетки необходимо снабжать предшественниками, но в низких концентрациях. Предшественники должны быть максимально близки в цепочке превращений к исходному продукту.

4. Желательно использовать клетки, которые секретируют необходимые метаболиты в питательную среду или клетки, у которых такую секрецию можно индуцировать.