Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Системы культивирования клеток

Существует 2 основных системы культивирования клеток.

1. Непроточные культуры — тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

Увеличить продолжительность жизни непроточных культур можно несколькими способами:

— прерывистый (часть культуры заменяется равным объемом свежей среды);

— постоянный (объем культуры увеличивается с постоянной низкой скоростью, а небольшие порции клеток периодически удаляются);

— перфузионный (осуществляется постоянное поступление свежей среды в культуру и одновременное удаление равного объема использованной (бесклеточной) среды. Перфузия может быть открытой, когда из системы удаляется вся среда, и закрытой, когда удаляемая среда проходит через дополнительный сосуд, где восстанавливается ее pH и осуществляется аэрирование, и возвращается в культуральный сосуд.

Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий.

2. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях.

Существует 2 крупных направления в культивировании животных клеток: монослойные культуры и суспензионные культуры.

Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Монослойные культуры также обладают рядом преимуществ:

1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.

2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.

3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.

4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.

5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.

Недостатками монослойных культур являются:

— требования большого пространства;

— возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;

— недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;

— сложности в определении и контролировании pH, концентрации кислорода.

Необходимо отметить, что применение микроносителей устраняет эти недостатки. Существует много различных разновидностей этого способа культивирования. Рассмотрим три основных направления (рис. 27):

1. Чашка Колле, плоский флакон с клетками на дне

2. Вращающаяся бутыль (круглый сосуд) с клетками на дне и стенках

Колонка с клетками на микроносителях pH, давление, СO2, температура система контроля и регенерации среда компоненты питательной среды стеклянные бусы перистальтический насос

1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).

2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520 % поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

Использование культуры клеток человека

Практически любые клетки человека могут быть введены в культуру и служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях.

Благодаря культивированию клеток возможности исследования и диагностики расширяются почти беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакции на различные агенты, в том числе и на лекарственные воздействия. Кроме того, если в ряду поколений воспроизводится дефект, свойственный клеткам in vivo, значит это дефект наследственный.

Наибольшее распространение получили культуры фибробластов. Широкое использование фибробластов для изучения патогенеза и диагностики наследственных болезней обусловлено не только легкостью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань, главным клеточным элементом которой являются фибробласты, составляет значительную часть массы тела. Кроме того, фибробласты составляют строму многих органов, являются важными участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения, необходимого для дифференцировки и функционирования специализированных клеток. В фибробластах имеется фермент моноаминоксидаза, изменения активности которого характерны для некоторых нервных и психических заболеваний. Фибробласты содержат рецепторы к глюкокортикоидным гормонам, инсулину, некоторым нейромедиаторам.

Гринбергом в 1978 году была доказана возможность экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo.

Во-первых, фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные клеткам в организме, а также онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организмадонора.

Во-вторых, не существует другого такого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма.

В-третьих, изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму при создании соответствующих условий.

Все вышеперечисленное также способствует использованию фибробластов для изучения клеточных, биохимических, молекулярных аспектов патогенеза ряда болезней, в том числе и связанных с наследственными дефектами нервной системы.

Культивирование клеток и тканей беспозвоночных

Интерес к клеточным культурам беспозвоночных связан с разнообразием и оригинальностью роста и метаморфоза, которые могут быть объектом для изучения основных процессов клеточной дифференцировки и регуляции активности генов. С другой стороны, при рассмотрении способов получения энтомопатогенных препаратов отмечалось, что вирусы могут размножаться только при использовании живых клеток насекомых, в связи с чем, для получения вирусных препаратов необходимым условием являлось предварительное разведение насекомых-хозяев. Использование клеточных культур беспозвоночных позволяет решить эту проблему.

Среды для культивирования клеток и тканей насекомых сильно варьируют по составу. При составлении сред используются данные по составу гемолимфы. Среды отличаются от сред для клеток и тканей млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением.

Для получения культуры клеток и тканей беспозвоночных используют эмбрионы, имагинальные диски и органы насекомых:

— имагинальные диски (зачатки взрослых органов насекомых) используют для изучения процессов дифференцировки in vitro;

— эмбрионы с удаленной оболочкой используют для изучения начальных стадий развития насекомых;

— отдельные органы для различных целей. Например, слюнные железы Diptera для изучения процессов пуффирования в политенных хромосомах (пуф вздутие хромосом при "включении" ДНК на транскрипцию, когда определенные участки ее раскручиваются и РНК-синтезирующие ферменты начинают синтез РНК; при линьке насекомых пуфы появляются в определенной последовательности).