Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

ГИБРИДИЗАЦИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

История метода

Предположение о том, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, было высказано еще в начале XIX века в связи с открытие многоядерных клеток. В историческом аспекте представляет интерес то обстоятельство, что открытие поликарионов как бы подтверждало ошибочное представление Шлейдена, который считал, что новые клетки зарождаются в виде пузырьков внутри цитоплазматической мембраны родительских клеток. Разделявший эту точку зрения Рудольф Вир хов представил в 1851 г. рисунок многоядерной опухолевой клетки в полной уверенности, что ядра являются эндогенными зачатками новых клеток. Кроме того, открытие поликарионов подлило масла в огонь борьбы с клеточной теорией. Противники ее выдвинули гипотезу, согласно которой организм представляет собой единую тканевую массу с непрерывной цитоплазмой, а существование поликарионов рассматривали как подтверждение этой гипотезы. Со временем восторжествовала клеточная теория, а существование поликарионов отнесли к разряду интересных исключений.

Гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах нашего столетия. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Исходные линии отличались по числу и морфологии хромосом, а также по способности к образованию опухоли при введении их мышам. Гибридные клетки содержали число хромосом, отличное от исходных клеточных линий, а также содержали поверхностные антигены клеток обеих родительских линий. Далее было установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных. В качестве агента, индуцирующего слияние, выступал инактивированный вирус HVJ, называемый также вирусом Сендай. С этих пор вирус Сендай стал широко использоваться в экспериментах по слиянию клеток.

При изучении межвидовых гибридных клеток, способных к пролиферации были сделаны два очень важных наблюдения:

— в гибридах могут проявиться оба генома;

— в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.

Слияние клеток не обязательно должно быть чем-то стимулировано. Как in vivo, так и in vitro оно может проходить и без добавления специальных агентов. Несмотря на то, что все слияния такого рода можно считать спонтанными, некоторые из них постоянно происходят в процессе онтогенеза, а следовательно, эволюционно запрограммированы. До сих пор нерешенной остается одна из труднейших загадок биологии, состоящая в том, что мембраны, находящиеся внутри клетки сливаются часто, тогда как мембраны, разграничивающие клетки, сливаются редко. Например, пузырьки аппарата Гольджи сливаются друг с другом, образуя клеточные пластинки при цитокинезе у растений, мембраны ЭР — с элементами АГ при переносе вновь синтезированных белков и т. д.

В то же время нормальные клетки в естественных условиях крайне редко сливаются друг с другом. Исключение составляет процесс оплодотворения. Кроме того, в качестве подобного рода исключения выступает процесс плазмогамии у высших грибов, когда одноядерные гаплоидные клетки сливаются, образуя двуядерные (дикарионы). Такие клетки размножаются митотически, оставаясь двуядерными, и в результате образуют всем хорошо известные плодовые тела.

В естественных условиях слияние клеток происходит и у млекопитающих. Например, клетки могут сливаться при формировании мышечных трубочек. Еще в XIX веке было показано, что миофибриллы поперечно-полосатых мышц образуются в поликарионах — крупных удлиненных многоядерных клетках. Поликарионы — продукт слияния одноядерных миобластов. Слияние опухолевых клеток — довольно обычное явление, при этом опухолевые клетки in vivo иногда сливаются и с нормальными. Эксперименты по спонтанному слиянию клеток проводились и in vitro. При проведении подобных экспериментов получают так называемых "химерных" или аллофеных мышей — животных, в тканях которых содержатся клетки различных генотипов (рис. 31).

Рис. 31. Получение аллофенных мышей

Методы создания химер

1. Агрегационный — был предложен практически одновременно и независимо друг от друга Тарковским в Варшаве и Минц в Филадельфии (1961–1962 гг.).

Из матки беременных самок-докторов извлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т. е. состоят из "белых" и "черных" клеток.

Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными. Такие белки называются изоферментами, и их можно разделить с помощью электрофореза. Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода — не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

2. Инъекционный — был разработан Р. Гарднером в 1968 г.

Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона — рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.

Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: М. muskulus и М. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту М. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона М. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку М. muskulus и благополучно развивались там, а в организме М. caroli погибали спустя две недели.

Межвидовые химерные зародыши между мышью и крысой путем агрегации были получены только в 70-х годах. Первые химерные животные были получены только в 1973 году Р. Гарднером и М. Джонсоном. Успех этих экспериментов позволил приступить в 80-х годах к созданию химерных сельскохозяйственных животных. Выяснилось, что агрегационный метод неприемлем для получения химер крупного рогатого скота. Химер телят Bos indicus + Bos taurus удалось получить только инъекционным методом.

В 1984 году были получены межвидовые химеры между овцой и козой — овцекозы, причем практически одновременно в Англии и ФРГ. Использовались оба метода. Половым путем овцы и козы не скрещиваются, так как имеют разный набор хромосом: коза 2n = 60, овца 2n = 54. В ФРГ в 1985 году были получены химерные телята после агрегации половинок 32-клеточных эмбрионов от коров швицкой (бурой) и голштино — фризской пород. В фенотипе химер сочетались обе масти — бурая и черно — пестрая.

Химерные животные не передают потомкам генетическую мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются. Но на протяжении 1 поколения хозяйственно ценные признаки поддерживаются, поэтому можно, например, сочетать как молочную, так и мясную продуктивность.

Химерность довольно часто встречается и у растений. Как правило, она существует в скрытом виде, не проявляясь фенотипически. Однако пластидные мутации позволяют увидеть ее непосредственно на растении. Чаще всего спонтанная химерность наблюдается у гетерозиготных растений. Различные клеточные типы четко разделены в пространстве, образуя отдельные слои при делении апикальных меристем. Примером видимой мутации хлоропластов и образования химерного растения является пестролистность или появление секторов ткани другого цвета.

Механизм слияния клеток

Для индукции слияния клеток используются вещества различной природы. Ионы Са2+, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай.

Лизолецитин — поверхностно-активное вещество липидной природы, продукт деградации лецитина путем обработки последнего фосфолипазой А. Лизолецитин повреждает мембраны и токсичен для живых систем. Цитотоксический эффект этого вещества можно уменьшить снижая его концентрацию или добавляя во время обработки альбумин.

Моноолеат глицерина также соединение липидной природы, но его повреждающее действие менее выражено, а частота слияния клеток при применении этого вещества возрастает в 4–7 раз по сравнению со спонтанным процессом. К другим агглютинирующим агентам, способность которых вызывать слияние клеток, была исследована специально, относятся лектины растений и антитела.

Преимущество вируса Сендай как сливающего агента заключается в полном отсутствии цитотоксического эффекта. Вирус перед употреблением инактивируют, облучая ультрафиолетовой лампой в течение 5 минут, при этом он теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки. Вирус Сендей имеет два недостатка:

— необходимость наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус;

— клетки растений и грибов не имеют рецепторов к этому вирусу, поэтому он неприменим для их гибридизации.

Первый этап слияния (рис. 32) — сближение мембран соседних клеток и уста новление между ними тесного контакта. Мембраны должны быть приближены друг к другу на расстояние в несколько ангстрем так, чтобы между ними стали возможны взаимодействия, подобные гидрофобным связям. Вызывают подобное сближение агенты, индуцирующие агглютинацию клеток. Миксовирусы, например, вирус Сендай, наряду с другими вирусами, которые не обусловливают слияния, прежде всего, вызывают агглютинацию клеток, т. е. достаточно тесное их сближение, необходимое для успешного последующего слияния.

Рис. 32. Этапы слияния клеток

(по Н. Рингертцу, Р. Сэвиджу, 1979):

А — 1-й этап, сближение цитоплазматических мембран: 1 — гликопротеиды, 2 — липиды, 3 — плазматические мембраны, 4 — митохондрии, 5 — микрофиламенты, 6 — частицы вируса Сендай;