Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Работа в ламинарном боксе

Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересадкой каллусов, тканей, микроорганизмов, ведут в специальных комнатах или ламинарных боксах, где обеспечиваются стерильные условия работы. Ламинарный бокс (ламинар) приспособление для работы в стерильных условиях. Асептические условия в ламинаре создаются с помощью тока воздуха. Ламинарное движение воздуха — движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Ток воздуха, проходя через ламинар, движется к исследователю[82], что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.

Подготовка бокса к работе

В специальных комнатах (микробиологических боксах) проводят влажную уборку с дезинфицирующими агентами. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами. Облучение ультрафиолетовыми лучами (260 нанометров) — наиболее часто используется в лабораториях для стерилизации помещений, настольных боксов. При длительном воздействии эти лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Непосредственно перед работой необходимо протереть настольный бокс или внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом[83], разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, простерилизованный инструмент и посуду.

Рабочее место при отсутствии ламинара

Наличие ламинара — это отлично, просто замечательно. Но что делать, если его нет? Или появится в обозримо-необозримом будущем, а культуры клеток заводить нужно уже сейчас?

Шаг первый — постарайтесь найти малопосещаемое людскими массами помещение — чем меньше посетителей — тем меньше источников загрязнения.

Шаг второй — всегда перед работой проводите влажную уборку всей комнаты и стерилизуйте ее кварцевой (ультрафиолетовой) лампой.

А теперь, собственно — о рабочем месте. В нашем случае оно выглядело примерно так: стол, покрытый ламинатом. Лучше — железный, но сойдет и покрашенный масляной краской. В идеале — поверхность стола должна быть негорючей. Именно поэтому железный стол — лучше всего. Ламинат тоже загорается не сразу, хуже всего в этом отношении масляная краска, а еще пуще всякие дерматины и сукно. Они противопоказаны категорически.

Прямо перед вами на столе должны лежать следующие предметы: кафельная плитка или кусок стекла размером 15x15 см или чуть больше. Кафельная плитка — лучше, она выдерживает нагрев, а стекло может лопнуть. Спиртовка, стаканчик с 96 % спиртом (или 200–300 граммовая высокая баночка из-под кофе, детского питания, фруктовых пресервов), широкая кисточка для рисования, мокрая марлевая салфетка или тряпочка размером 30х30, свернутая в несколько раз (смочена водой!), пинцет, скальпель, пробирки/баночки с питательной средой, пробирки/чашки Петри с материалом для размножения.

Порядок работы

Протираете влажной тряпочкой поверхность стола, ополаскиваете тряпочку и выжимаете ее. Кладете свернутую под ПРАВУЮ руку, справа от кафельной плитки. Располагаете подручные средства. Кафельная плитка лежит прямо перед вами, в центре рабочего места. За кафельной плиткой по центру стоит спиртовка. Рядом с ней, на расстоянии 10 см или чуть больше стоит стаканчик со спиртом, получается, он будет находиться сразу за тряпочкой справа от вас. Слева от плитки располагаются пробирки со средой и материал, который вы будете вводить в культуру или пассировать. Расстояние от плитки до среды и от плитки до тряпочки не менее 10 см влево и вправо, соответственно. Скальпель и пинцет погружены в спирт примерно на 2/3 своей длины (поэтому важно, чтобы баночка была узкой и высокой и была почто до верха наполнена спиртом. Кисточка также стоит в стаканчике со спиртом.

Берете кисточку, мажете спиртом поверхность плитки. Ставите кисточку в спирт. Зажигаете спиртовку, вынимаете скальпель, поджигаете в пламени спиртовки и поджигаете горящим скальпелем спирт на поверхности плитки. Кладете скальпель справа на кафельную плитку (она может еще продолжать гореть) так, чтобы острие скальпеля смотрело вверх (то есть на ребро плитки), но так, чтобы большая часть скальпеля, включая острие, находилось именно над плиткой, в пламени. Правой рукой берете пинцет из баночки со спиртом, перекладываете в левую руку, поджигаете от спиртовки и кладете слева на плитку — аналогично скальпелю. ВНИМАНИЕ — если вы проводите эти процедуры впервые — отрабатывайте навыки, окуная инструменты в спирт на четверть длины и не пугайтесь пламени, оно исчезает в течение минуты. Влажная тряпочка — ваша страховка на случай, если вы подожжете что-то не то, например, запаникуете и бросите горящий инструмент в баночку со спиртом. Тогда сразу накрывайте влажной тряпкой источник огня, без доступа кислорода огонь тухнет моментально.

В результате этих манипуляций вы имеете абсолютно стерильную поверхность плитки со стерильными инструментами на ней. Постарайтесь контролировать свои движения и доставать экспланты, открывать пробирки не над плиткой непосредственно, а в зоне между плиткой и горящей спиртовкой, то есть за плиткой. На стерильной плитке вы можете резать эксплант, класть его пинцетом на кончик скальпеля для последующего переноса на питательную среду и она должна оставаться стерильной. Старайтесь не трясти над ней рукавами халата. Использованные инструменты снова погружаете в спирт. Перед каждым новым эксплатном все операции по стерилизации, начиная с обжигания поверхности плитки, повторяются. Помните, что скальпель вы держите указательным и большим пальцем (он лежит на указательном и среднем, зажатый большим пальцем, а крышки с пробирок снимаете мизинцем, предварительно пронеся горлышко пробирки через пламя спиртовки.

Стерилизация растительного экспланта

Стерильная культура — культура, свободная от эпифитных и ризосферных микроорганизмов.

Работающий должен вымыть руки с мылом и протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.

Перед стерилизацией объекта его тщательно моют теплой водой с мылом, промывают дистиллированной водой, очищают от излишних тканей, снимают кожуру у корнеплодов и корней, кору у побегов, поверхностные листья у верхушек побегов, промывают дистиллированной водой и помещают на несколько секунд в 70 % спирт (семена на 1–2 минуты). После этого сегменты корней, побегов, стеблей, клубней или семена переносят в стерилизующий раствор.

Вид стерилизующего агента, его концентрация и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани экспланта. Для поверхностной стерилизации растительных объектов применяют следующие средства стерилизации: сулему (двуххлористая ртуть) (0.1 %), хлорамин (2-10 %), гипохлорит кальция (7-10 % Са(ClO)2) или натрия (NaOCl), перекись водорода (13–18 %) и др. Хлорамин можно купить в аптеке. Для стерилизации можно использовать также хлорсодержащие растворы отбеливателей из хозяйственных магазинов, например, средство "Белизна". Свежие растворы отбеливателей при стерилизации нежных эксплантов, таких как молодые листочки, нужно разводить в 2 или даже в 3 раза. Эффективность стерилизации возрастает при добавлении нескольких капель твина-80 и твина-20 на литр стерилизующего раствора.

Продолжительность стерилизации меристем сулемой — 5 минут, семян — 15–20 минут, пергидролем соответственно 15 и 30 минут.

После стерилизации материал переносят в стерильную дистиллированную воду, выдерживают 10 минут, затем меняют воду ещё два раза, выдерживая в каждой порции по 15–20 минут. В стерильных чашках Петри или на стерильных листах бумаги, или на обожженной кафельной плитке обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.

Ход работы

Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков и выращивания каллусных тканей.

1. Завернуть в плотную бумагу и простерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу стеклянную посуду — колбы, чашки Петри.

2. Подвергнуть предварительной стерилизации в сушильном шкафу скальпели и пинцеты. Перед помещением в сушильный шкаф завернуть инструменты в плотную бумагу.

3. Простерилизовать в автоклаве дистиллированную воду в колбе. Для получения стерильной воды налейте в колбу 1/3 часть объема дистиллированной воды, закройте ватной пробкой, а сверху плотной бумагой или целлофаном, можно обернуть горлышко фольгой. Автоклавировать 30 минут при 1 атмосфере.

4. Простерилизовать в автоклаве в течение 20 мин при давлении 1 атм. пробирки с питательной средой, закрытые фольгой или ватными пробками, обернутыми плотной бумагой или целлофаном.

Питательные среды для растительных биотехнологических объектов

Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, Р, К, Са, S, Mg, Fe, В, Zn, Сu, Со, Mn, J, Мо); витамины B1, В6, В12, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.

На средах без гормонов растут "привыкшие" и опухолевые ткани.

Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.

Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) — 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) — 0.1–2 мг/л, ИУК — 1-30 мг/л.

Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.

В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (ЕАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.

Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:

— среда без глюкозы — для хлореллы, цианобактерий;

— среда без витаминов и гормонов — для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);