Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Среди генов азотфиксации выявлены гены, контролирующие структуру нитрогеназы, белковый фактор, принимающий участие в транспорте электронов, регуляторные гены. Регуляция генов азотфиксации довольно сложна, поэтому генно-инженерный перенос азотфиксирующей функции от бактерий непосредственно высшим растениям в настоящее время уже не обсуждается. Как показали эксперименты, даже в самом простом эукариотическом организме — дрожжах не удалось добиться экспрессии nif-генов, хотя они и сохранялись в течение 50 генераций.

Эти опыты показали, что диазотрофность (азот-фиксация) свойственна исключительно прокариотическим организмам, и nif-гены не смогли преодолеть барьер, разделяющий прокариоты и эукариоты, из-за слишком сложной своей структуры и регуляции генами, расположенными вне nif-области. Возможно, более удачным окажется перенос nif-генов с помощью Ti-плазмид в хлоропласты, поскольку механизмы экспрессии генов в хлоропластах и в клетках прокариот близки. В любом случае нитрогеназа должна быть защищена от ингибирующего действия кислорода. Кроме того, фиксация атмосферного азота — очень энергоемкий процесс. Вряд ли растение под влиянием nif-генов может так кардинально изменить свой метаболизм, чтобы создать все эти условия. Хотя не исключено, что в будущем методами генетической инженерии можно будет создать более экономно работающий нитрогеназный комплекс.

Более реально использование генноинженерных методов для решения следующих задач: повышение способности ризобии колонизировать бобовые растения, повышение эффективности фиксации и ассимиляции азота путем воздействия на генетический механизм, создание новых азотфиксирующих микроорганизмов путем введения в них nif-генов, передача способности к симбиозу от бобовых растений к другим.

Первостепенной задачей генетической инженерии для повышения эффективности биологической фиксации азота является создание штаммов ризобии с усиленной азотфиксацией и колонизирующей способностью. Колонизация бобовых растений ризобиями протекает очень медленно, лишь единичные из них дают начало клубенькам. Это происходит потому, что местом инвазии ризобии является только одна небольшая область между точкой роста корня и ближайшим к ней корневым волоском, находящимся на стадии формирования. Все остальные части корня и развившиеся корневые волоски растения нечувствительны к колонизации. В ряде случаев сформировавшиеся клубеньки оказываются неспособными фиксировать азот, что зависит от многих растительных генов (выявлено не менее пяти), в частности от неблагоприятного сочетания двух рецессивных генов.

Традиционными методами генетики и селекции удалось получить лабораторные штаммы ризобий с более высокой колонизирующей способностью. Но они в полевых условиях испытывают конкуренцию со стороны местных штаммов. Повышение их конкурентоспособности, видимо, можно осуществить генноинженерными методами. Повышение эффективности процесса азотфиксации возможно применением генноинженерных приемов, основанных на увеличении копий гена, усилении транскрипции тех генов, продукты которых образуют «узкое» место в каскадном механизме азотфиксации, путем введения более сильных промоторов и т. п. Важно повышение коэффициента полезного действия самой нитрогеназной системы, осуществляющей непосредственное восстановление молекулярного азота в аммиак.

Повышение эффективности фотосинтеза

С4-растения характеризуются высокими темпами роста и скоростью фотосинтеза, у них практически отсутствует видимое фотодыхание. У большинства сельскохозяйственных культур, относящихся к С3-растениям, высокая интенсивность фотодыхания. Фотосинтез и фотодыхание — тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность одного и того же ключевого фермента — рибулозобисфосфат-карбоксилазы (РуБФК). РуБФ-карбоксилаза может присоединять не только СО2, но и О2, то есть осуществляет реакции карбоксилирования и оксигенирования. При оксигенировании РуБФ образуется фосфогликолат, который служит основным субстратом фотодыхания — процесса выброса СО2 на свету, в результате чего теряется часть фотосинтетических продуктов. Низкое фотодыхание у С4-растений объясняется не отсутствием ферментов гликолатного пути, а ограничением оксигеназной реакции, а также реассимиляцией СО2 фотодыхания.

Одной из задач, стоящих перед генетической инженерией, является исследование возможности создания РуБФК с преобладающей карбоксилазной активностью.

Получение растений с новыми свойствами

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы — фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.

Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен — это газообразный гормон[76], одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях — для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt т. д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т. д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты (явление сайлесинга — замолкания генов). Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. М. А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу. Не менее интересен и другой аспект работ — получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров — это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

Проблемы биобезопасности трансгенных растений

Одним из главных возражений против употребления "трансгенных" продуктов питания является наличие во многих из них генов устойчивости к антибиотику (в частности, к канамицину), которые содержались в исходной конструкции ДНК в качестве селективных.

Предполагается, что эти гены устойчивости могут при переваривании пищи передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы могут приобрести резистентность к данному антибиотику. Однако в реальности вероятность такого события ничтожно мала — многочисленные эксперименты и наблюдения в природе относительно подобного горизонтального переноса генов до сих пор давали только отрицательные результаты.

Не стоит забывать, что встраиваемые в растения гены устойчивости "настроены" для экспрессии лишь в эукариотических, но не бактериальных клетках. Надо учесть и то, что эти селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике. Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем при употреблении трансгенных растений. Однако, учитывая настроения общественности, разрабатываются подходы, для исключения присутствия "подозрительных" генов в коммерциализированных трансгенных формах.

В большинстве случаев маркерные гены устойчивости к антибиотикам сейчас заменяют на гены устойчивости к гербицидам. Правда, применение "гербицидных" генов также встречает возражения, но уже защитников окружающей среды. Предложено несколько способов избирательной элиминации маркерного гена после получения желаемого трансгенного растения, когда он фактически уже не нужен.

Очень перспективным представляется замена селективных генов на репортерные при отборе трансгенных форм растений, либо использование альтернативных селективных генов, таких как гены синтеза фитогормонов или гидролиза особых форм полисахаридов при выращивании растений в культуральной среде. Таким образом, даже эта виртуальная опасность, связанная с генами устойчивости к антибиотику, в скором времени перестанет существовать.

Что касается возможной токсичности или аллергенности трансгенных растений, то здесь применяют те же жесткие стандарты, как и для полученных традиционным путем новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания. Никаких особых отличий трансгенных растений от обычных по этим параметрам ожидать не приходится (разве что в лучшую сторону при блокировании синтеза токсинов или аллергенов), да и действительно, как правило, не наблюдается на практике.