Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях. Через 7–9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33–35 °C, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.

При производстве вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы. При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.

Масляную форму препарата получают путем диспергирования осадка в стерильном 50 % растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а затем добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам. Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.

Бактериальные удобрения на основе клубеньковых бактерий

Микрофлора почвы оказывает непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста и развития улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.).

В настоящее время выпускают[63] такие бактериальные удобрения, как нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин, экстрасол.

Отечественная промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

Бактерии рода Rhizobium — строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.

Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) — аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.

Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение — Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli — для фасоли, Rhizobium lupini — для люпина, сараделлы и т. д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.

Задачей производства бактериальных удобрения является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых форм препарата с сохранением активности в течение гарантийного срока хранения.

Отечественная промышленность выпускает два вида нитрагина: почвенный и сухой. Впервые культура клубеньковых бактерий на почвенном субстрате была приготовлена в 1911 году на бактериально-агрономической станции в Москве. В настоящее время его производство имеет ограниченное значение, так как технология довольно сложна и трудоёмка при выполнении отдельных операций. Более перспективна технология производства сухого нитрагина.

Сухой нитрагин — порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5–7 %. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2 % агара и 1 % сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1–2 суток при 28–30 °C и pH 6.5–7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2–3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70–80 %. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации (в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75 % клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2–1 кг, хранят при температуре 15 °C не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15–25 %.

Препарат клубеньковых бактерий может выпускаться и в виде ризоторфина. Впервые торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг. Для приготовления ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100 °C и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30–40 % торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5–6 °C и влажности воздуха 40–55 %. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следую-

Обработка семян бобовых культур прочно вошла в мировую сельскохозяйственную практику. Крупнейшими производителями таких препаратов являются США и Австралия.

Технология получения азотобактерина

Азотобактерин — бактериальное удобрение, содержащее свободноживущий почвенный микроорганизм Azotobacter chroococcum, способный фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара. Внесенные в качестве удобрения в почву бактерии также выделяют биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин и др.). Эти вещества стимулируют рост растений. Кроме того, продуцируемые Azotobacter фунгицидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере растения.

Все виды Azotobacter строгие аэробы. Чувствительны к содержанию в среде фосфора и развиваются лишь при высоком его содержании в питательной среде. Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком (вообще содержание в среде связанного азота угнетает азотфиксацию). Стимулируют процесс фиксации азота соединения молибдена.

Установлено, что при фиксации азота процесс его восстановления протекает на одном и том же синтезируемом азотобактером ферментном комплексе и лишь конечный продукт (аммиак) отделяется от фермента. Нитрогеназная азотфиксирующая система представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден и SH-группы.

Микробиологическая промышленность выпускает несколько видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной. Технология получения сухого азотобактерина имеет много общего с технологией производства сухого нитрагина. Сухой азотобактерин — активная культура высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г препарата содержится не менее 0.5 млрд. жизнеспособных клеток. Культуру микроорганизма выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно вводят только сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты, pH 5.7–6.5.