Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ АССОЦИАЦИЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ С МИКРООРГАНИЗМАМИ

Цели создания ассоциаций

Создание искусственных ассоциаций — новое, сравнительно молодое направление клеточной инженерии по получению новых клеток и клеточных систем путем введения микроорганизмов в клетки или в популяции культивируемых клеток растений. Экспериментальные клеточные системы называются ассоциациями.

Ассоциации могут быть как внутриклеточные (эндосимбиотического типа), так и межклеточные (экзосимбиотического типа).

В первом случае микроорганизмы вводят в изолированные протопласты высших растений. Во втором — совместно культивируют клетки и ткани растений с микроорганизмами.

При создании ассоциаций предполагается, что клетки и их популяции должны приобретать новые свойства, обусловленные присутствием в них микроорганизмов.

Цели создания популяций:

1. Экспериментальная проверка гипотезы теории симбиотического происхождения эукариотической клетки, которое предположительно проходило через стадии эндо- и экзосимбиоза. Реконструкция отдельных стадий эволюционного процесса симбиогенеза.

2. Моделирование природных симбиотических отношений растений и микроорганизмов, играющих огромную роль в процессе фиксации атмосферного азота (обеспечение связанным азотом природных экосистем, а также агроценозов).

3. Повышение продуктивности растительных клеток-продуцентов экономически важных веществ.

4. Получение растений с новыми свойствами, при условии, что отношения, складывающиеся между клетками партнеров при совместном выращивании, сохраняются в растениях-регенерантах. В литературе обсуждаются возможность улучшения таким способом сельскохозяйственных растений, а также получение растений со способностью к автономной фиксацией азота.

Первые две цели имеют значение для решения теоретических вопросов биологии, последние две носят ярко выраженный прикладной характер.

Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений

Одна из целей культивирования растительных клеток — получение важных для медицины и ряда отраслей промышленности веществ. Для того чтобы производство было рентабельным, необходимо культивировать их на простых по составу пита тельных средах. В то же время, среды достаточно сложны по составу и включают в себя витамины, гормоны, источники углеродного питания, так как клетки в культуре являются гетеротрофами или обладают ограниченной способностью к фотосинтезу. Совмещение в культивируемых клетках способности к фотосинтезу и биосинтезу специфических продуктов — маловероятно. Поэтому введение в такие культуры микроорганизмов, синтезирующих субстраты для роста растительных клеток или предшественники для биосинтеза полезных веществ представляется весьма заманчивым.

В микробиологии опыт смешанного культивирования есть. Он показывает, что системы микроорганизмов более эффективны, чем монокультуры. Их используют для очистки сточных вод, получения ферментов, биологически активных веществ (ауксины, витамины, антибиотики). Считается, что в биотехнологии найдут применение смешанные популяции, включающие в себя как сочетания нескольких штаммов микроорганизмов, так и представителей царств растений и животных.

Улучшение сельскохозяйственных растений предполагает получение растений, способных к фиксации молекулярного азота.

При внесении удобрений используется от 30 до 50 % внесенного азота. Другой путь поступления азота — биологическая фиксация молекулярного азота. Большая часть осуществляется азотфиксирующими симбионтами, но этот процесс характерен лишь для некоторых видов высших растений и микроорганизмов. Для повышения доли биологической фиксации азота используют 3 подхода:

1. Инокуляция азотфиксирующими микроорганизмами (бактериальные удобрения). Недостаток — низкая выживаемость интродуцируемых чистых культур и вытеснение их естественной почвенной микрофлорой.

2. Создание азотфиксирующих растений методами генной инженерии. При этом предлагается вводить гены nif в протопласты высших растений. Препятствия на этом пути: процесс требует большого количества энергии, которой нет в растительной клетке, нет также систем транспорта, запасов железа и молибдена, необходимых для синтеза нитрогеназы, нет систем защиты нитрогеназы от инактивации кислородом.

3. Введение целых азотфиксирующих организмов в растения. Такие ассоциации должны учитывать особенности организации природных азотфиксирующих симбиозов:

— целостность обоих партнеров,

— интеграция партнеров в пределах организма макросимбионта,

— относительная обособленность макросимбионта.

С помощью клеточной инженерии можно осуществить жизнедеятельность азотфиксирующих организмов в клетках и тканях культурных растений. При этом возможна проверка большого числа сочетаний партнеров. В процессе культивирования возможна также адаптация партнеров друг к другу. Кроме того, бактериальные симбионты могут быть интегрированы в ткани растений с сохранением их интактности, что позволит оградить нитрогеназу от кислорода, выделяемого растением в процессе фотосинтеза.

В настоящее время эти положения могут быть подтверждены рядом экспериментов.

Создание эндосимбиотических ассоциаций

В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы следующих систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии, цианеллы.

Существует несколько способов введения микроорганизмов в протопласты (рис. 25):

Рис. 25. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты высших растений

(по L. Folke, O.Gamborg, 1981)

1. Эндоцитоз (инвагинация плазмалеммы), при этом везикула с микроорганизмом высвобождается в цитоплазме протопласта.

2. Интеграция (слияние) мембран протопласта и микроорганизма, органеллы водорослей высвобождаются в цитоплазму протопласта, но при этом они не окружены плазмалеммой протопласта.

3. Заключение микроорганизма в искусственные мембраны — липосомы. Например, в протопласты лука вводили цианобактерии, заключенные в липидные капли.

Каждый из методов имеет свои достоинства и недостатки. В первом случае везикулы окружены цитоплазматической мембраной протопласта, в результате чего может произойти слияние с лизосомами и разрушение микроорганизма.

Во втором случае происходит нарушение целостности микроорганизма: в цитоплазме оказываются органеллы.

а) эндоцитоз (поглощение путем инвагинации мембраны)

б) слияние мембран

в) слияние мембраны протопласта с липосомой

В третьем случае в цитоплазме оказываются интактные микроорганизмы, что является одним из условий воспроизведения естественного симбиоза. Такого же результата можно достичь используя метод микроинъекций (например — цианобактерий) в пространство между стенкой и плазмолированной клеткой лука. Этот способ можно рассматривать либо как стадию перед попаданием бактерий в цитоплазму, либо как получение ассоциаций межклеточного типа.

К сожалению, жизнеспособных систем на основе изолированных протопластов в настоящее время не получено, так как в процессе культивирования происходило разрушение либо микроорганизма, либо протопласта. Необходимы дальнейшие исследования.

Экзосимбиотические ассоциации

Партнеры те же, в основном — азотфиксаторы (Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum), Chlorella и различные виды грибов. Общий принцип создания таких ассоциаций — совместное культивирование клеток растений с микроорганизмами. Способы ведения микроорганизмов в культуру могут быть различны: внесение микроорганизмов непосредственно в культуру; высев на поверхности агара рядом с каллусом, но без соприкосновения; разделение бактериальных клеток и культуры мембранами, обеспечивающими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими контакта между партнерами.

Рассмотрим результаты попыток создания ассоциаций с различными партнерами.

Ассоциации с клубеньковыми бактериями

Сначала создавались упрощенные модельные системы для изучения симбиоза бобовых растений с клетками растений. Каллусную ткань сои инфицировали клетками Rhizobium. Были получены подобия инфекционных нитей и бактероидов в каллусной клетке. В таких ассоциациях клетки бактерий проявляли нитрогеназную активность (НГА, отсутствующую в чистой культуре. Это свидетельствовало о процессе азотфиксации.

Далее были созданы и азотфиксирующие ассоциации Rhizobium с культурами тканей небобовых растений. В таких ассоциациях клетки бактерий были локализованы на поверхности растительных клеток, проникали вглубь каллуса по межклетникам и изредка обнаруживались внутри клеток. В основном сохраняли палочковидную форму без образования бактероидов. В большинстве таких экспериментов бактериальные клетки угнетали рост растительных и усиливали их отмирание. Сообщения о положительном взаимном влиянии единичны. Есть одна удачная попытка регенерации растений табака из ассоциации каллусной ткани с Rhizobium.

Ассоциации со свободноживущими азотфиксаторами

Azotobacter, Azospirillum живут в ризосфере растений и иногда образуют с ними ассоциации. Главная задача проведения экспериментов с этими бактериями — получение эффективных азотфиксирующих систем, растущих на среде без связанного азота, с перспективой регенерации растений.

В таких экспериментах была обнаружена видовая специфичность. Каллусные культуры табака, проса быстро "обрастали" Azospirillum, но через 4 недели погибали. Ткань сахарного тростника субкультивировали в аналогичных условиях 18 месяцев, при этом стабильные ассоциации формировались только на среде с низким содержанием связанного азота или без него. Бактерии проявляли НГА во всех случаях.

И Azotobacter, и Azospirillum в соответствующих ассоциациях были локализованы на поверхности или в межклетниках и никогда не проникали внутрь клетки. Растения-регенеранты пока не получены.

Ассоциации с зелеными водорослями

Каллус моркови инокулировали одним из штаммов Chlorella, культивировали на свету на среде с дефицитом азота, каллус жил несколько месяцев. Контрольные же растения погибали. Клетки водоросли не проникали внутрь растительных.

Ассоциации с грибами

Ткань руты раздельно культивировали с различными грибами, при этом на клетки растений влияли диффундирующие через агар выделения гриба. В некоторых случаях добавляли культуральную жидкость грибов. Совместное культивирование с Botritis allii увеличивало синтез алкалоидов в 10 раз по сравнению с контролем, а добавление культуральной жидкости — в 50 раз.

Цианобактерии в искусственных ассоциациях с растительными клетками

Цианобактерии как партнеры в искусственных ассоциациях имеют ряд особенностей:

— предполагают, что древние цианобактерии сыграли роль в формировании эукариотической клетки;

— чаще других фототрофов вступают в симбиотические отношения с другими организмами в природе;